Si nous pouvions remonter 2020 à ses débuts et obtenir une reprise, il y a de fortes chances que nous fassions beaucoup de choses différemment. Il y a une tonne de blâme à faire sur COVID-19, mais il est sûr de dire que l'un des plus grands échecs de tout cet épisode a été le manque de tests rapides, précis et bon marché pour le SRAS-CoV-2, le virus derrière le pandémie actuelle. Ce n’est pas par manque d’informations; après tout, les scientifiques chinois ont publié la séquence du génome viral très tôt dans la pandémie, et les chercheurs du monde entier ont fait de même pour toutes les informations qu'ils ont tirées du virus alors qu'il se déchaînait autour de la planète.

Mais tirer parti de ces informations dans des diagnostics utilisables a été tout sauf un processus fluide. Initialement, la seule méthode de détection du virus consistait à effectuer des tests de réaction en chaîne par transcriptase-polymérase inverse (RT-PCR), un processus difficile qui nécessite des techniciens qualifiés et un laboratoire bien équipé, prend des jours à des semaines pour renvoyer des résultats, et ne peut que dire si le patient a une infection en cours. Le test d'anticorps a le potentiel pour un test rapide et facile, sans laboratoire, mais ne peut être utilisé que pour voir si un patient a déjà eu une infection dans le passé.

Ce qui est nécessaire à mesure que la crise du COVID-19 se poursuit, c'est un test avec la spécificité et la sensibilité de la PCR combinée à la rapidité et la simplicité d'un test d'anticorps. C’est là qu’un nouveau test, basé sur les dernières méthodes de biologie moléculaire et baptisé «STOPCovid», entre en jeu et pourrait jouer un rôle majeur dans le diagnostic, maintenant et dans le futur.

Immunité bactérienne

Dans la mesure où CRISPR est entré dans le lexique populaire, il est considéré comme une technique nouvelle et puissante pour éditer le génome des organismes, potentiellement comme un moyen de traiter les troubles génétiques. C'est certainement une grande partie de l'histoire, et celle qui va à juste titre gagner un prix Nobel à quelqu'un dans les 15 prochaines années, mais elle ne raconte pas toute l'histoire. Les racines des méthodes d'édition des gènes CRISPR se trouvent dans le monde bactérien, et comment ces organismes unicellulaires ont développé un système immunitaire sophistiqué qui ressemble fortement au système immunitaire humain.

Avec tout le stress que nous mettons à éviter, détecter et traiter les infections virales, il pourrait être surprenant pour certaines personnes qu'il existe des milliers de virus qui ont évolué pour attaquer les bactéries. On estime que ces bactériophages, ou phages pour faire court, sont dix fois plus nombreux que leurs hôtes bactériens, ce qui signifie que la Terre a quelque chose comme 1030 particules phagiques, un nombre qui éclipse largement la population de tout organisme. Et comme tout autre virus, comme la grippe ou le SRAS-CoV-2, l'activité d'un phage consiste à trouver un hôte approprié, à injecter son matériel génétique et à prendre le contrôle de la machinerie cellulaire pour se faire plus d'elle-même, détruisant généralement l'hôte dans le processus. .

Il va donc de soi que les bactéries auraient développé des mécanismes pour détecter et échapper aux infections virales. C'est là que de courtes répétitions palindromiques régulièrement espacées, ou CRISPR, entre en jeu. Les séquences CRISPR sont essentiellement une collection de fragments d'ADN qui ont été coupés du matériel génétique des phages envahisseurs. Ces séquences courtes, appelées espaceurs, sont ajoutées au génome bactérien par un ensemble d'enzymes appelées protéines associées CRISPER (Cas).

Les espaceurs sont la clé de l'immunité bactérienne. Avec certaines des séquences répétitives adjacentes dans le segment CRISPR, les espaceurs sont transcrits en fragments d'ARN complémentaires appelés crRNA, ou CRISPR-RNA. Les ARNc se lient à des protéines comme Cas9, une enzyme associée à CRISPER qui peut à la fois dérouler l'ADN et le couper. La section de l'ARNr de l'espaceur lui permet de se lier à l'ADN de phage dont l'espaceur est originaire, ce qui signale à Cas9 de couper l'ADN de phage envahisseur. Aucun ADN de phage, aucune infection et le fait d’avoir l’espaceur intégré dans le génome de la bactérie signifie que lui et ses descendants ont une mémoire de ce phage particulier.

La découverte de l'importance de CRISPR dans l'immunité bactérienne a naturellement conduit à des méthodes de génie génétique basées sur l'enzymologie CRISPR-Cas qui vont bien au-delà de ce qui peut être accompli avec les techniques de biologie moléculaire antérieures, basées principalement sur des endonucléases de restriction. Ces enzymes, qui font également partie du système immunitaire des bactéries, ont évolué pour couper l'ADN à de courtes séquences de paires de bases spécifiques; il y a des centaines de choix, mais vous êtes coincé à couper dans les séquences de reconnaissance naturelles ou à utiliser d'autres techniques de génie génétique pour insérer les séquences où vous le souhaitez. CRISPR-Cas vous permet de dicter exactement où les coupes auront lieu, quelle que soit la séquence.

Dommage collatéral

L'incroyable utilité des techniques CRISPR a conduit à la découverte de plus d'enzymes Cas, chacune avec des propriétés différentes. Une telle enzyme, Cas13, a des propriétés très intéressantes et utiles. Comme Cas9, Cas13 utilise un ARNc transcrit à partir de la région CRISPR comme modèle pour reconnaître les phages envahisseurs. Mais plutôt que de se lier à l'ADN puis de le cliver, Cas13 cible l'ARN phagique, le clivant à la séquence spécifiée par l'espaceur dans l'ARNr. Une fois que cela se produit, Cas13 devient un peu bâclé, clivant tout fragment d'ARN à portée de main, quelle que soit la séquence. C’est un peu comme couper votre numéro de compte dans un relevé bancaire, pour ensuite prendre tous ces minuscules morceaux de papier et les passer dans une déchiqueteuse, juste pour être sûr.

Ce sont ces dommages collatéraux non spécifiques à l'ARN par Cas13 qui ont conduit au développement d'une méthode CRISPR baptisée SHERLOCK, pour Déverrouillage enzymatique spécifique à haute sensibilité. Développé en 2017 dans le laboratoire de Feng Zhang au Broad Institute of MIT, SHERLOCK utilise de minuscules fragments rapporteurs d'ARN qui ont été marqués aux deux extrémités avec des marqueurs différents. Après une première étape d'amplification de l'ARN, Cas13 trouve et clive son ARN cible. Une fois activé, il continue de découper tout ARN qu'il peut trouver, y compris les fragments d'ARN rapporteur ajoutés à la réaction. Les deux marqueurs sur le rapporteur ne sont séparés l'un de l'autre par ce clivage collatéral que si la séquence cible est présente, permettant à SHERLOCK de détecter des infections virales avec une spécificité extrême et une sensibilité exquise; dans les tests diagnostiques initiaux, l'ADN viral de patients infectés par le virus Zika a pu être détecté dans la gamme attomolaire, soit environ 2 000 copies du virus par millilitre d'échantillon.

Pour toute son utilité, cependant, la procédure SHERLOCK est toujours un processus de laboratoire difficile. Comme le processus de réaction en chaîne de la transcriptase inverse-polymérase qui est actuellement l'étalon-or pour les tests COVID-19, un test de diagnostic basé sur SHERLOCK nécessiterait des techniciens formés et un laboratoire bien équipé pour effectuer, le potentiel de contamination croisée comme les multiples tubes de réaction sont accessibles et seraient toujours soumis à des retards en raison de l'expédition des échantillons et du retour des résultats.

Pour corriger ces problèmes, le laboratoire de Zhang a proposé une version beaucoup plus simple du test SHERLOCK appelée STOPCovid, pour Tests SHERLOCK dans un seul pot. Ils ont optimisé l'amplification de l'ARN et les étapes de reconnaissance et de clivage de Cas19 pour fonctionner ensemble dans un tampon à une seule température, réduisant ainsi le nombre de manipulations nécessaires pour chaque échantillon testé. Cela réduit considérablement le risque d'erreurs de laboratoire et rend le processus suffisamment simple pour fonctionner dans des laboratoires même mal équipés.

Laboratoire sur un bâton

Schéma du processus STOPCovid. Source: STOPCovid

Pour rationaliser encore plus le processus, les fragments rapporteurs d'ARN ont été repensés pour permettre la détection via des anticorps. Cela peut sembler un pas dans la mauvaise direction, car, comme nous l'avons vu précédemment, le test de dépistage des infections à COVID-19 ne peut détecter que si un patient a créé des anticorps dirigés contre le virus du SRAS-CoV-2, et en raison du temps qu'il faut pour faire c'est plus d'un indicateur retardé d'infection. Mais dans le test STOPCovid, les anticorps ne sont pas utilisés pour détecter les protéines virales, mais comme un moyen de séparer les marqueurs d'ARN clivés, qui sont marqués avec deux protéines différentes. Cela ouvre la possibilité d'utiliser un test à écoulement latéral, où l'action capillaire tire la solution de réaction le long des bandes qui ont des anticorps contre les protéines d'étiquette qui leur sont appliqués. Cela permettra aux prestataires de soins de santé d'utiliser une bandelette de test similaire à un test de grossesse pour lire les résultats du test STOPCovid, transformant l'ensemble du processus en un test au point de service.

Comme pour tout dans le domaine médical, il y a un long chemin entre le laboratoire et la clinique. Les essais doivent être menés, les litiges de propriété intellectuelle doivent être réglés et les fabricants doivent être alignés. En attendant, cependant, le Dr Zhang et ses collègues n'attendent pas. Ils ont mis le protocole STOPCovid complet à la disposition de tous, avec tous les détails sur la façon d'exécuter la réaction et d'interpréter les résultats. Ils indiquent très clairement que cela n'est pas destiné à un usage clinique pour le moment, mais le simple fait qu'ils sont prêts à publier les informations et à s'inquiéter des détails plus tard est assez encourageant.

Avec la capacité de détecter une infection actuelle similaire grâce à l'analyse des acides nucléiques combinée à la facilité d'utilisation d'un test d'anticorps à flux latéral, STOPCovid pourrait être une véritable révolution dans les tests viraux, non seulement pour COVID-19 mais pour les infections virales venir.

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